topogen TG2000H-2現(xiàn)貨說明書

人拓撲異構酶IIα酶–500單位

Human Topoisomerase IIα Enzyme – 500 Units

Human Topoisomerase IIα Enzyme

純化的人拓撲異構酶IIα（Top2a）過表達，并在SDS-PAGE上純化至單一條帶的均一性。拓撲異構酶II高度純化，無核酸酶污染。

人拓撲異構酶IIα質量控制試驗

核酸污染：通過檢測線性kDNA和線性質粒DNA的形成來檢測。在37°C（在top2a測定條件下，含或不含ATP）下，將1µg連環(huán)KDNA或超螺旋pUC19 DNA孵育4小時。

通過在抑制人類topo IIa活性的條件下測定超螺旋DNA的松弛來評估與topo I的交叉污染。將過量純化的酶與pRYG DNA在37°C條件下，在不存在ATP（含或不含Mg++）的情況下孵育2小時。在這些條件下，不得檢測到pRYG超螺旋DNA的松弛。

當SDS-PAGE凝膠過載純蛋白時，可以看到170kDa的主帶。最終餾分中沒有180kDa拓樸II形式。（不同批次的蛋白質濃度不同，但通常在5-50μg/ml的范圍內(nèi)）人類拓撲異構酶IIα的供應量為2-10單位/ul（37°C時，1個單位將在30分鐘內(nèi)降解0.2μg KDNA）。注意，單位定義基于優(yōu)選的DNA底物kDNA（動粒DNA）。我們建議將kDNA底物與這種酶一起使用，因為質粒DNA弛豫測定幾乎不那么敏感。活性基于kDNA脫鏈（而非質粒DNA松弛）進行驗證。

top2酶的最終部分來自FPLC柱，在以下緩沖液中：10%甘油、50mM Tris（pH 7.7）、1mM EDTA和EGTA、650mM NaCl。

人拓撲異構酶IIα測定條件和性能質控

使用在拓撲II反應緩沖液（50mM Tris-Cl，pH 8.0，120mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM ATP，0.5mM二硫蘇糖醇）中最終體積為20-30µl的動載體DNA（KDNA）底物和0.2µg KDNA進行鏈連接測定。用5µl（每20µl反應體積）的終止緩沖液（5%沙科西、0.0025%溴酚藍、25%甘油）終止反應。反應產(chǎn)物在含有0.5ug/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上分析。當凝膠運行時，用手持紫外光源可以容易地監(jiān)測2.5kb DNA微環(huán)脫鏈產(chǎn)物的分辨率。

酶在干冰上運輸，應在-70°C下儲存。我們還建議在第一次解凍后等分酶（反復冷凍/解凍會導致活性喪失）；酶活性穩(wěn)定1-2天（不更長）。