雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 (高通量）說(shuō)明書(shū)

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時(shí)，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國(guó)產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來(lái)讓每一個(gè)和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國(guó)生物制造企業(yè)，圓夢(mèng)中國(guó)。

產(chǎn)品詳情

產(chǎn)品描述

報(bào)告基因檢測(cè)常用于研究真核生物基因表達(dá)調(diào)控，螢火蟲(chóng)螢光素酶 和海腎螢光素酶可以分別催化底物螢光素(luciferin)和腔腸素(coelenterazine)發(fā)出生物螢光(bioluminescence)，這種發(fā)光反應(yīng)具有良好的光學(xué)特征和濃度線性范圍，同時(shí)檢測(cè)的靈敏度高，可達(dá)到 10-20mol。兩種催化反應(yīng)最適濃度不同，因此互不干擾， 配合使用形成一套高靈敏的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，其中海腎螢光素酶常作為內(nèi)參照。

螢火蟲(chóng)螢光素酶是一種分子量約為 61 kDa 的蛋白，在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在此過(guò)程中會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)約為 560 nm 的生物螢光。海腎螢光素酶是一種分子量約為 36 kDa 的蛋白，在氧氣存在的條件下，催化腔腸素(Coelenterazine)氧化成 coelenteramide，在此過(guò)程中會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)約為 480 nm 的生物螢光。在后加入海腎螢光素酶底物時(shí)，可有效淬滅螢火蟲(chóng)熒光素酶催化 luciferin 的發(fā)光，而不干擾海腎螢光素酶的活性，從而實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。生物螢光可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或)或多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)螢光素酶與其底物催化發(fā)光的體系，可以高效、靈敏地檢測(cè)基因的表達(dá)。檢測(cè)原理如圖所示：

圖 1.熒光素酶報(bào)告基因反應(yīng)原理圖

產(chǎn)品組成

試劑盒組分：

運(yùn)輸與保存

冰袋運(yùn)輸，-20℃保存 6 個(gè)月，-80℃保存更長(zhǎng)時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 試劑準(zhǔn)備：

（1）1x Universal lysis Buffer（ULB）配置：取所需體積的 5x Universal lysis Buffer 臨用前用三蒸水稀釋至1x；

（2）Fluc buffer A 工作液：試劑盒開(kāi)始啟用時(shí)，將 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate 中，適當(dāng)吹打搖勻至粉末充分溶解后，分裝到棕色管中-20℃保存?zhèn)溆茫?/span>

（3）Rluc Buffer B 工作液：臨用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀釋至 1x 用（按需配置），配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 內(nèi)使用有效（試劑配置過(guò)程中注意避光）。

2. 細(xì)胞裂解:

（1） 細(xì)胞裂解：取出孔板放置至恢復(fù)室溫，加入適量體積 1x ULB 振蕩器搖勻，室溫裂解 15min。細(xì)胞裂解液推薦使用量：

（2） 熒光酶標(biāo)儀設(shè)定，正確開(kāi)啟儀器，點(diǎn)擊檢測(cè)，選擇生物發(fā)光檢測(cè)功能，根據(jù)本批樣本的靈敏度選擇合適增益與積分時(shí)間，默認(rèn)為增益 135，積分時(shí)間 10 s。

3. 檢測(cè)：

1)移液槍吹打混勻裂解液后，吸取 20 μL 到黑色孔板底部。（樣品數(shù)量過(guò)多時(shí)候建議使用移液槍經(jīng)轉(zhuǎn)移和后續(xù)加液操作，若使用四周不透光的培養(yǎng)板可省略轉(zhuǎn)移操作）

2)向每孔中加入 100 μL Fluc buffer A，輕柔快速吹打混勻三次后，室溫孵育反應(yīng) 5-10min 后，上機(jī)檢測(cè)記錄發(fā)光值（F 值）。

  3)向每孔中加入 100 μL Rluc buffer B，輕柔快速吹打混勻三次后，室溫孵育反應(yīng) 5-10min 后，上機(jī)檢測(cè)記錄發(fā)光值（R 值）。

（為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，在加入 Fluc buffer A 或Rluc buffer B 后，請(qǐng)?jiān)?/span> 1h 內(nèi)完成檢測(cè)）

實(shí)驗(yàn)案例分析

在 96 孔板中接種適量細(xì)胞過(guò)夜至貼壁狀態(tài)，第二天進(jìn)行如下轉(zhuǎn)染：1.含有FXR 基因啟動(dòng)子區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體質(zhì)粒；2.含有 FXR 基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子 E2 功能的重組表達(dá)載體質(zhì)粒；3.海參熒光素酶重組表達(dá)載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染 6h 向每孔中加入不同單體藥物培養(yǎng) 48h，其中設(shè)置空白溶劑 DMSO 組。最后按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作裂解隨后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)，結(jié)果如下（對(duì)應(yīng)孔中所標(biāo)白色字體數(shù)值為陽(yáng)性激動(dòng)劑的激動(dòng)倍數(shù)）

圖 3 . 59 種單體藥物對(duì)X 基因啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因激動(dòng)倍數(shù)熱圖（A1:為空白溶劑對(duì)照組；A2-J6: 59

種 FDA 上市藥物的實(shí)驗(yàn)組）

經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)的高通量篩選確定 F3 孔對(duì)應(yīng)單體藥物對(duì)FXR 啟動(dòng)子區(qū)激動(dòng)效果強(qiáng)，激動(dòng)倍數(shù)為 45。同某進(jìn)口“P"品牌一同測(cè)定該藥物對(duì)FXR 基因的激動(dòng)曲線，并計(jì)算 EC₅₀，結(jié)果如下：

圖 4.紅色：起發(fā)生物品牌測(cè)定 F3 單體藥物激動(dòng) FXR 基因啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因響應(yīng)曲線；黃色：進(jìn)口“P"品牌測(cè)定F3 單體藥物激動(dòng) FXR 基因啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因響應(yīng)曲線（EC50）

1. 數(shù)據(jù)分析：

（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，每組實(shí)驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照組，對(duì)照組和處理組。

a. 空白對(duì)照組

背景 F：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白對(duì)照組樣品量須與實(shí)驗(yàn)樣品量相同，且與實(shí)驗(yàn)樣品含有相同的培養(yǎng)基/血清組合。

b. 對(duì)照組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞未經(jīng)實(shí)驗(yàn)因素處理 (即對(duì)照組 F 和對(duì)照組 R)。

c. 實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)化合物處理 (即實(shí)驗(yàn)組F 和實(shí)驗(yàn)組 R)。

計(jì)算結(jié)果：對(duì)照組比值=(對(duì)照組 F-背景 F)/(對(duì)照組 R-背景 R)，實(shí)驗(yàn)組比值=(實(shí)驗(yàn)組 F-背景 F）/(實(shí)驗(yàn)組 R-背景 R)。

表達(dá)倍數(shù)= 實(shí)驗(yàn)組比值/對(duì)照組比值。

注意事項(xiàng)

（1） 反應(yīng)溫度：酶促反應(yīng)對(duì)溫度較為敏感，加樣檢測(cè)前務(wù)必將檢測(cè)試劑以及細(xì)胞培養(yǎng)液平衡至室溫（20-25℃）。

   （2） 檢測(cè)儀器：能檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測(cè)得的光信號(hào)值也會(huì)不同。 檢測(cè)板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光酶標(biāo)板。

（3） 發(fā)光信號(hào)會(huì)受到檢測(cè)環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響，應(yīng)確保同組內(nèi)不同樣本檢測(cè)條件一致。

（4） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套。

    （5） 本產(chǎn)品僅作科研用途！