發(fā)光法支原體檢測試劑盒說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢中國。

產(chǎn)品詳情

產(chǎn)品描述

《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》通過檢測支原體含有的特異性 ATP 合成相關酶的活性以達到檢測體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞是否被支原體污染的目的。

在支原體裂解后，該支原體特異性的酶，在底物存在下，具有將 ADP 轉(zhuǎn)化成 ATP 的功能。由于熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的反應需要 ATP 的參與，支原體特異性酶催化產(chǎn)生的 ATP 含量，可以通過該反應轉(zhuǎn)化成生物發(fā)光（Bioluminescence）信號，該信號可以使用專門的發(fā)光檢測儀（Luminometer）或具有發(fā)光檢測功能的多功能酶標儀進行檢測，發(fā)光的強度與 ATP 的含量成正比。

具體的反應如下：通過比較細胞培養(yǎng)上清和未用于細胞培養(yǎng)而成分相同的培養(yǎng)液二者的支原體特異性酶的含量，即可知道培養(yǎng)的細胞是否被支原體污染。

產(chǎn)品特點

《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》具有如下顯著的優(yōu)點：

1. 檢測時間短。整個檢測過程只需 30 分鐘左右。

2. 《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》檢測的是活支原體，只有樣品中存在活的支原體，才會生產(chǎn)陽性結果，可以區(qū)分支原體的死活。而《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》都是檢測支原體的DNA，不論支原體的死活，樣品中只要有支原體DNA的存在，就會生產(chǎn)陽性結果，所以無法區(qū)分支原體的死活。細胞培養(yǎng)中，最關心的是細胞培養(yǎng)液上清或者血清、胰酶等成分中，是否有活的支原體。而如果僅有死的支原體或者一些殘存的支原體 DNA，是無關緊要的。

3. 不存在假陽性。由于《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》都需要對支原體 DNA 進行大量的擴增，檢測過程中，只要有微量的支原體 DNA 或者擴增產(chǎn)物的污染，就會出現(xiàn)假陽性。而《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》只檢測活的支原體，不存在擴增產(chǎn)物污染樣品的問題。

4. 不存在因反應被抑制導致的假陰性。由于細胞培養(yǎng)數(shù)天后，培養(yǎng)液中經(jīng)常含有嚴重抑制PCR擴增的代謝物， 所以使用《PCR 法支原體檢測試劑盒》經(jīng)常會出現(xiàn)假陰性的問題。該問題在《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》不存在。

5. 《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》對支原體的識別率高：由于本試劑盒依賴的支原體特異性酶普遍存在，其具有廣譜的識別能力。

產(chǎn)品組分

（1） 支原體檢測溶液：5.5 mL

（2） 試劑 A(已凍干)：2.5 mL（50 次檢測）

（3） 試劑 B(已凍干): 2.5 mL（50 次檢測）

使用方法

使用方法

1. 檢測試劑的分裝和保存

收到的產(chǎn)品為凍干品，溶解前，請放-80 ℃冰箱低溫保存。第一次使用前，在冰上操作，分別用 2.5 mL 支原體檢測溶液溶解試劑 A 和試劑 B（注意：因為試劑 A 和試劑 B 的離心管容量不足 2.5 mL，可以分別先用 1 mL 支原體檢測溶液將凍干的試劑 A 和試劑 B 溶解后，轉(zhuǎn)移到一個 5 mL 或 10 mL 的離心管中，再各補加 1.5 mL 支原體檢測溶液）, 按每管 50 μL 分別分裝到 50 個 1.5 mL 離心管中，立即放-80 ℃冰箱低溫保存。

2. 陰性對照的設置

本試劑盒每次檢測都必須設置陰性對照。陰性對照必須使用配制完后放于 4℃冰箱，未用于細胞培養(yǎng)但成分相同的培養(yǎng)液，包括其中的血清、抗生素等含量也必須相同。特別是其中的血清含量和批次，對發(fā)光的本底值影響很大，作為陰性對照的培養(yǎng)液，其中添加的血清，必須與用于細胞培養(yǎng)的血清批次相同且含量相同。例如：如果用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液為含有 10%的胎牛血清的高糖 DMEM，那么陰性對照也應該使用含有相同批次的 10%的胎牛血清的高糖 DMEM。如果用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液，那么陰性對照也應該使用無

血清但成分相同的培養(yǎng)液。

上述陰性對照的選取是按照嚴格的方式進行的。如果確實沒有成分相同的培養(yǎng)液，也可以使用成分接近的培養(yǎng)液作為陰性對照。如果有些樣品實在沒有合適的陰性對照或者不知道樣品原來的培養(yǎng)基組成，可以嘗試使用含10%血清的 DMEM 培養(yǎng)基作為陰性對照。

3. 陽性對照的設置

如果您實驗室擁有經(jīng)其他支原體檢測方法（比如本公司的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》或者《PCR 法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》等）檢測為陽性的細胞系，其培養(yǎng) 3 天后的上清即可以直接按照后文的樣品準備方法，自己制備陽性對照。

如果您沒有上述陽性樣品，那么陽性對照也可以從我們公司單獨購買（貨號：LPC10）。如果第一次使用《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》，建議購買一支本公司的《發(fā)光法支原體檢測試劑盒陽性對照》。

4. 待測樣品的準備

為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養(yǎng)液樣品最好來源于至少培養(yǎng) 2-3 天且匯合度在 70-90% 左右的細胞培養(yǎng)液上清（貼壁細胞）。懸浮培養(yǎng)的細胞也需要在換液傳代后，至少讓細胞生長 2-3 天再取培養(yǎng)液進行檢測。具體操作如下（請嚴格按照相應的體積進行操作）：

（1）根據(jù)濃縮倍數(shù)，可以取 180-1500 μL 上述待測樣品到 1.5 mL 離心管內(nèi)，在普通臺式離心機上 1000 rpm (大約 150 g)低速離心 5 minutes，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管內(nèi)（注意：轉(zhuǎn)移離心上清時，請保留底部 60 μL 左右的液體，以防止將底部細胞沉淀吸走?。?，丟棄含細胞沉淀的原有離心管。

（2）將含有上清的新的 1.5 mL 離心管，在普通臺式離心機上 16000 g （大約 13000 rpm）高速離心 5 分鐘， 沿離心管內(nèi)壁離心時的內(nèi)側(cè)面將離心后的上清小心緩慢全部吸走并丟棄（注意：勿讓吸頭碰到離心管內(nèi)壁的底部 外側(cè)，因為底部外側(cè)可能含有支原體的沉淀！）。往離心管內(nèi)，加入 120 μL 作為陰性對照的培養(yǎng)液。

（3）將上述經(jīng)過離心清洗一次的樣品， 再次在普通臺式離心機上 16000 g （大約 13000 rpm）高速離心 5 分鐘【離心時注意保持離心管放置的方向與上述步驟（2）相同】，同樣小心吸走 115 μL 離心后的上清并丟棄（注意：同樣勿讓吸頭碰到離心管內(nèi)壁的底部外側(cè)。留下大約 5 μL 培養(yǎng)液的目的也是為了防止吸頭碰到離心管底部外側(cè)而將可能含有支原體的沉淀吸走）。往離心管內(nèi)，加入 115 μL 作為陰性對照的培養(yǎng)液（此時，總體積仍然為 120 μL）。

（4）將上述經(jīng)過離心清洗兩次的樣品，用移液槍上下吹吸 10-20 次，將可能含有支原體的沉淀吹打均勻。至此，該樣品方可用于后續(xù)的支原體檢測（夠兩次檢測使用）。

（5）吸取 50 μL 陰性對照、陽性對照或者已經(jīng)經(jīng)過低速離心去除細胞和經(jīng)過高速離心替換成陰性對照的培養(yǎng)液的待測樣品，放入黑色（優(yōu)先選擇）或者白色不透明的 96 孔板內(nèi)，加入 50 μL 冰上放置的試劑 A，室溫反應 15 分鐘。

（6）室溫反應 15 分鐘后，加入 50 μL 冰上放置的試劑 B，無需等待，立即在具有發(fā)光檢測功能的多功能酶標儀或者單獨的發(fā)光檢測儀（Luminometer）上，以儀器默認的螢火蟲熒光素酶（Luciferase）的發(fā)光檢測參數(shù)進行發(fā)光值的檢測，5 分鐘內(nèi)，連續(xù)測 5 次陰性對照和待測樣品的發(fā)光值，計算各自的平均值。

注意事項

1、 本試劑盒只在 96 孔板進行過測試。因為發(fā)光值會隨時間略有變化，如果使用單管的發(fā)光檢測儀，盡量保證陰性對照和待測樣品加入試劑 A 后的反應時間和加入試劑 B 后到發(fā)光值檢測的反應時間相同。

2、 問：如果配制完后放于 4℃冰箱未用于細胞培養(yǎng)且成分相同的培養(yǎng)液本身有支原體污染（比如加入的血清本身含支原體），是否仍然可以用作陰性對照？

答：可以。因為：即使作為陰性對照的培養(yǎng)液本身有支原體污染，其中的含量也是極其微量的。而待測樣品是經(jīng)過培養(yǎng) 3 天以上的，其支原體在這 3 天培養(yǎng)過程中，會大量繁殖，用《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》檢測的發(fā)光值，肯定比陰性對照的發(fā)光值高得多。